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ELISA檢測非特異性顯色原因分析
更新時間:2013-09-18   點(diǎn)擊次數(shù):1465次

         酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)自問世以來,以其敏感性高,特異性強(qiáng),操作簡便、安全,開創(chuàng)了免疫學(xué)診斷的新紀(jì)元在臨床診斷方面得到了廣泛的應(yīng)用。但是ELISA試劑在它的研究、生產(chǎn)及使用中常常會碰到非特異性顯色問題,ELISA試劑盒特異性、檢驗(yàn)標(biāo)本中含酶標(biāo)記物的干擾物,操作不當(dāng)?shù)纫蛩囟紩?dǎo)致這樣的結(jié)果。本文就在實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的一些原因及如何采取一些措施,消除非特異性顯色作以分析。
1、試劑盒特異性因素
1、1 固相載體的選擇
        ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種,以微量滴定板zui為常見。它具有良好的吸附性能,孔底透明度高,空白值低,各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此,在選擇ELISA試劑盒同時要對其使用的微孔板型號進(jìn)行認(rèn)證,評估。
1、2包被物的純度
        在酶聯(lián)免疫測定尤其是間接ELISA中,試劑的特異性取決于使用抗原的純度。目前由于技術(shù)條件的限制,包被用抗原或抗體的純度不可能達(dá)到100%,所以有些非特異性顯色不可避免,只能盡可能提高純度,提高特異性。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原。
1、3包被抗體的效價
具有高親和力和高特異性的包被抗體,是決定試劑特異性的重要方面。
1、4 封閉
        是ELISA中重要的一步,目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙,減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾。

2、檢驗(yàn)標(biāo)本中含有酶標(biāo)記物的干擾物
2、1內(nèi)源性干擾物
        風(fēng)濕因子(RF)、黃疸等,類風(fēng)濕因子是可作用于多種動物以及人IgGFc段的自身抗體,多數(shù)為IgM類,能充當(dāng)抗原成分與固相及酶標(biāo)抗體反應(yīng),從而呈現(xiàn)非特異性顯色。
黃疸血標(biāo)本中常含有內(nèi)源性過氧化物酶,如用辣根過氧化物酶為標(biāo)記物,就有可能產(chǎn)生非特異性顯色。
2、2 外源性干擾物
         常因樣品采集、貯存、處理不當(dāng)造成如樣品溶血,被細(xì)菌污染,標(biāo)本凝集不全等。溶血標(biāo)本,紅細(xì)胞溶解破裂,釋放出血紅素形成,而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物,以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中,溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色。如有細(xì)菌污染,菌體中可能含有內(nèi)源性HRP(辣根過氧化酶),有國內(nèi)報(bào)道酶免HBsAg試劑檢測溶血標(biāo)本時可造成假陽性。如在冰箱中保存過久,其中的IgG可發(fā)生聚合,在間接法ELISA中可使本底加深。因此,血標(biāo)本在采集處理時應(yīng)小心,在冰箱中保存不易過久。

標(biāo)本凝集不全時,血清中會殘留部分纖維蛋白原,也易造成假陽性。

3、操作過程中的問題造成假陽性
3、1加樣
        對于間接ELISA標(biāo)本一般都要進(jìn)行稀釋,如果加樣不準(zhǔn)就會造成誤差,尤其當(dāng)稀釋倍數(shù)大時,很小的誤差,會導(dǎo)致較大的相對誤差,使陰性(或弱陽性)標(biāo)本呈陽性(或陰性)。加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡。目前,大部分血站都已使用全自動酶免加樣系統(tǒng)處理標(biāo)本,可較好地避免以上誤差。
3、2洗滌
        在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復(fù)結(jié)果的關(guān)健一步,應(yīng)引起操作者重視。無論是手工操作還是機(jī)器操作,得出不正確的結(jié)果常與不正確的洗滌有關(guān),ELISA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。
3、3 溫育
         每種試劑都有其*反應(yīng)模式,其中溫度和溫育時間控制是重要因素。因孵育溫度高,反應(yīng)時間長,會造成整板本底高,陽性率高。溫育一般用濕盒或水浴,反應(yīng)板不宜疊放,以保證各板溫度都能迅速平衡,為避免蒸發(fā),板上應(yīng)加蓋。
3、4酶標(biāo)儀判讀
        作為記錄測定結(jié)果的儀器,酶標(biāo)儀的性能穩(wěn)定與否,決定結(jié)果的可靠度。首先酶標(biāo)儀應(yīng)定期進(jìn)行保養(yǎng),對濾光片要定期校正;其次酶標(biāo)儀波長設(shè)置要正確,使用雙波長,一個檢測波長,一個參比波長,以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾。此外,在用酶標(biāo)儀讀數(shù)時先擦試微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標(biāo)儀性能有所不同,使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說明書

         綜上所述,盡管目前上以及我國有了部分標(biāo)準(zhǔn)血清或參比血清(血清盤),但是酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)目前在技術(shù)上尚未做到標(biāo)準(zhǔn)化。受方法學(xué)及技術(shù)條件的限制,在酶聯(lián)免疫吸附測定中有時不可避免的會出現(xiàn)一定的非特異性,我們可以通過以上措施把非特異性顯色降至zui低限底,從而提高檢測的特異性,并得到更準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

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